凝胶层析 原理 参数 实验操作流程 应用 优缺点
前言：凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用**广，商品名是sephadex型号很多，从g10到g200。凝胶层析技术广泛用于生物化学，高分子化学等众多领域。凝胶层析技术具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 （一）凝胶层析原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，单个凝胶珠本身象个"筛子”，不同类型凝胶的筛孔的大小不同。当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的 （二）凝胶层析相关参数
2.1外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需的洗脱液的体积。 2.2分配系数
分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 2.3排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的**小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以他们同时被**先洗脱出来。 2.4分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。 2.5吸水率和床体积
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水分。 2.6凝胶颗粒的大小
层析用的凝胶一般都是球形，颗粒大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（m）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果好，但流速慢。一般比较常用的是100-200目。 （三）试验操作流程
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。在预处理的过程中为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。 3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太长或是太短都影响分离效果，而且层析柱的内径和高度应有一定的比例。 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度l与直径d的比值l/d一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
4. 加样与洗脱 样品体积不宜过多，**好为床体积的1%～5%，**多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和ph值。 5．洗脱液收集 样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。 6．凝胶柱的重复使用与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡**乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。 （四）凝胶层析的应用
⑴ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为sephadexg-10、15、25或bio-gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
